SpinTech
HiQ

Наборы для выделения нуклеиновых кислот высокой степени очистки

Подробнее

Набор SpinTech HiQ Plasmid Miniprep Extraction Kitдля выделения плазмидной ДНК в формате «мини»

Инструкция

Назначение

Набор для выделения плазмидной ДНК в формате «мини» SpinTech HiQ Plasmid Miniprep Extraction Kit предназначен для выделения плазмидной ДНК из культуры клеток бактерий. Выделенная ДНК может быть использована для ПЦР, секвенирования, рестрикции и других молекулярно-генетических методов/анализов. Набор предназначен для использования в научно-исследовательских лабораториях и не должен использоваться в диагностических или терапевтических целях.

Принцип работы

Набор использует модифицированный метод щелочного лизиса для отделения плазмидной ДНК от остального содержимого клетки. Бактерии лизируют в щелочных условиях, а лизат впоследствии нейтрализуется и доводится до условий связывания с высоким содержанием соли за один шаг. После этапа лизиса образец готов к очистке на спин-колонке, заполненной сорбентом на основе кремния. Благодаря оптимизированным буферам в лизате ДНК будет адсорбироваться, в то время как РНК, клеточные белки и метаболиты не удерживаются на мембране, и будут в проходящем потоке. Затем спин-колонка промывается буферным раствором для удаления любых оставшихся примесей. Буферы содержат хаотропные агенты, такие как гидрохлорид гуанидина или мочевина, которые денатурируют белки и разрушают РНК, оставляя плазмидную ДНК нетронутой. Затем плазмидную ДНК элюируют с мембраны на основе кремния водой без нуклеазы или буфером.

Необходимое оборудование
• Центрифуга для пробирок 15 мл на 5 000 g с охлаждением.
• Настольная центрифуга для пробирок 1,5–2,0 мл на 12 000 g.
• Миницентрифуга-вортекс.
• Автоматические дозаторы на 20, 200 и 1000 мкл.
• Аспиратор (опционально).
Дополнительные материалы
• Этиловый спирт (96%–99%).
• Изопропанол (100%).
• Пробирки 15 мл.
• Микроцентрифужные пробирки 1,5 мл и 2,0 мл, свободные от ДНКаз/РНКаз.
• Наконечники для дозаторов, свободные от ДНКаз/РНКаз (мы рекомендуем наконечники для пипеток с аэрозольными фильтрами для предотвращения контаминации).
Условия хранения и срок годности
• Транспортировка: при комнатной температуре (15–25ºC).
• Хранение: буфер TRB хранить при 2–8ºC после добавления РНКазы, остальные компоненты хранить при комнатной температуре.
• Срок годности: 12 месяцев.
Кат. No

TLPL 007 - 50 выделений
TLPL 008 - 100 выделений

Протокол

1. Подготовка растворов перед первым использованием набора
1.1. Растворите РНКазу А с помощью 1 мл буфера TRB. Добавьте весь раствор РНКазы А в емкость с оставшимся буфером TRB.
1.2. Добавьте этанол/изопропанол, во флаконы с концентратами промывочных буферов TPW1 и TPW2. Необходимое количество указано на этикетке флакона.
2. Выделение плазмидной ДНК
2.1. Подготовьте и промаркируйте пробирки объемом 15 мл для каждого образца.
2.2. Для выделения необходимо 3–5 мл бактериальной культуры плотностью 2-3 (OD 600). Осадите клетки центрифугированием при 5 000 g в течение 10 мин при 4°C. Удалите супернатант.
2.3. Ресуспендируйте осажденные клетки в 250 мкл буфера TRB. Бактериальный осадок следует ресуспендировать пипетированием и с использованием вортекса до тех пор, пока не останется никаких клеточных комков.
ВАЖНО! убедитесь, что РНКаза А была добавлена в конечной концентрации 100 мкг/мл к буферу TRB перед использованием для ресуспендирования.
2.4. Добавьте 250 мкл буфера TLB и осторожно перемешайте, переворачивая пробирку 4–6 раз, пока раствор не станет вязким и слегка прозрачным. Инкубируйте в течение 3–5 мин при комнатной температуре.
ВАЖНО! не используйте вортекс для перемешивания, чтобы избежать выхода хромосомной ДНК; не инкубируйте более 5 мин, чтобы избежать денатурации суперспирализованной плазмидной ДНК.
2.5. Добавьте 350 мкл буфера TNB и сразу же перемешайте, перевернув пробирку 5–8 раз.
2.6. Центрифугируйте при 8 000 g в течение 5 мин для осаждения клеточного детрита и хромосомной ДНК.
2.7. Промаркируйте необходимое количество спин-колонок для каждого образца, поместите их в пробирки для сбора.
2.8. Перенесите супернатант в очистную спин-колонку путем декантации или пипетирования.
2.9. Центрифугируйте при 12 000 g в течение 1 мин. Удалите проточную жидкость и поместите спин-колонку обратно в ту же пробирку для сбора.
2.10. Добавьте 500 мкл промывочного буфера TPW 1 на спин-колонку.
2.11. Центрифугируйте при 12 000 g в течение 1 мин. Удалите проточную жидкость и поместите спин-колонку обратно в ту же пробирку для сбора.
2.12. Добавьте 500 мкл промывочного буфера TPW2 на спин-колонку. Центрифугируйте при 12 000 g в течение 1 мин. Удалите проточную жидкость и поместите спин-колонку обратно в ту же пробирку для сбора.
2.13. Центрифугируйте при 12 000 g в течение 1 мин для удаления остатков промывочного раствора.
2.14. Промаркируйте чистые пробирки на 1,5 мл соответственно образцам.
2.15. Перенесите спин-колонку в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
2.16. Добавьте 50 мкл буфера TEB на спин-колонку.
2.17. Инкубируйте в течение 2 мин при комнатной температуре.
2.18. Центрифугируйте при 12 000 g в течение 1 мин. Элюат содержит выделенную ДНК.
Очищенная плазмидная ДНК может быть использована или храниться при -20°C.
Производитель наборов для выделения нуклеиновых кислот SpinTech HiQ

Techinvention Lifecare Pvt Ltd

201, Mangalam Industrial Park, Manoharpur, Jaipur-Delhi Highway, Jaipur (Rajasthan), India (Certified to ISO 9001 & ISO 13485)
CRM-форма появится здесь